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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:luen4-opus-145326
URL: http://opus.uni-lueneburg.de/opus/volltexte/2019/14532/


Einsatz der Planarchromatographie mit wirkungsbezogener Detektion zur Untersuchung von Wässern

Use of planar chromatography with effect-directed detection for the analysis of water

Weiß, Stefan Christian

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SWD-Schlagwörter: Planarchromatographie , Detektion , Wasseranalyse
Freie Schlagwörter (Deutsch): Chromatographie , Wasseruntersuchung
Freie Schlagwörter (Englisch): planar chromatography , analysis oof water , detection
Institut: Institut für Nachhaltige Chemie und Umweltchemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Ruck, Wolfgang (Prof. Dr.-Ing.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 20.09.2018
Erstellungsjahr: 2018
Publikationsdatum: 11.03.2019
Kurzfassung auf Deutsch: Unter Wirkungsbezogener Analytik (WBA) wird die Kopplung eines chromatographischen Trennverfahrens mit einem biologischen Testsystem verstanden. Der Vorteil bei dieser Herangehensweise ist, dass die zuvor getrennten Probeninhaltsstoffe anhand ihrer Aktivität mit einem in vitro-Testsystem detektiert werden. Es hat sich gezeigt, dass die Hochleistungsdünnschichtchromatographie (HPTLC) besonders geeignet für die WBA ist [1, 2]. Die Literaturrecherche ergab, dass die WBA mit der HPTLC an unterschiedlichen Proben z. B. Pflanzextrakte oder Wasserproben durchgeführt wurden. Doch bislang konnte nicht gezeigt werden, dass die WBA mit HPTLC auch als routinefähige Methode eingesetzt wurde. In dieser Arbeit erfolgte eine Optimierung der Detektion der Endpunkte Biolumineszenzhemmung (Aliivibrio fischeri), antibiotische Wirkung (Bacillus subtilis), Neurotoxizität (Acetylcholinesterase) von der HPTLC-Platte hinsichtlich Routinefähigkeit. Zusätzlich konnte in ersten Versuchen gezeigt werden, dass es möglich ist, direkt gentoxische Verbindungen mittels des umu-Tests auf der HPTLC-Platte nachzuweisen.
Für die einzelnen Biotests sind unterschiedliche Inkubationszeiten, die von Minuten bis Stunden reichen, notwendig. Dies führt aufgrund von Diffusion auf der HPTLC-Platte zu einer Bandenverbreiterung. Es wurden unterschiedliche Methoden und Arbeitsweisen zur Verminderung der Diffusion erprobt und optimiert. Eine Möglichkeit ist die mechanische Eindämmung durch die Einbringung einer Gaze in eine verfestigte Calciumalginatschicht. Optimiert wurde dieses Verfahren am Bacillus subtilis-Hemmtest. Hier konnte gezeigt werden, dass zwar durch das Einbringen der Gaze die Sensitivität sinkt, aber bislang wurde noch kein geeigneteres Material gefunden.
Für Enzymtests ist eine vergleichsweise kurze Inkubationszeit notwendig, daher tritt hier eine geringere Bandenverbreiterung auf, womit eine mechanische Einschränkung der Diffusion nicht geeignet ist. Um die auftretende Bandenverbreiterung möglichst gering zu halten,
wurde besonders die Aufbringung des Substrats optimiert. Dies geschah am Beispiel des HPTLC-Acetylcholinesterasehemmtests. Durch Aufsprühen des Substrats konnte das Ergebnis im Vergleich zu dem in der Literatur beschriebenen Verfahren wesentlich verbessert werden. Die Ermittlung der unterschiedlichen bandenverbreiternden Einflussfaktoren wie beispielsweise Inkubationszeit, Auftragegeschwindigkeit und Konzentration des Substrats und deren gegenseitige Beeinflussungen (Wechselwirkungen) erfolgte mittels statistisches Versuchsplanung. In absteigender Reihenfolge hatten folgende Faktoren den größten Einfluss auf die Zielgröße Bandenverbreiterung: Substratmenge > Wechselwirkung von Substratmenge und Umsatzzeit des Substrats > Umsatzzeit des Substrates = Enzymaktivität. Anhand dieser Erkenntnis konnte die Methode soweit optimiert werden, dass die bei der Detektion von AChE-Inhibitoren auftretende Bandenverbreiterung sehr gering gehalten werden kann. Aufgrund der hohen Empfindlichkeit des Verfahrens lassen sich selbst geringe Spuren von Verunreinigungen in Referenzsubstanzen detektieren.
Besonders für den Routineeinsatz der WBA mit der HPTLC ist die Vergleichbarkeit der Ergebnisse erforderlich. Dazu wurde anhand des HPTLC-Leuchtbakterienhemmtests mit Aliivibrio fischeri eine Auswertestrategie erarbeitet. Die Ermittlung der Biolumineszenzhemmung findet analog zum Küvettentest statt und kann ortsaufgelöst als Hemmwert-Chromatogramm dargestellt werden. Die Darstellung der Hemmung in einem Hemmwert-Chromatogramm gleicht die Stauchung der Peaks aufgrund des sigmoiden Verlaufs der Dosis-Wirkungsbeziehung teilweise aus. Durch die nichtlineare Beziehung zwischen Konzentration bzw. Flächenmasse und Wirkung der unbekannten Substanzen ist es für den Vergleich von Proben notwendig, einen Bezugspunkt zu setzen. Bewährt hat sich dafür der EC50-Wert. Da aber in den meisten Fällen die Konzentration unbekannt ist, wird als Bezugspunkt das Auftragevolumen gewählt, welches erforderlich ist um eine Hemmung von 50 % auszulösen. Der Kehrwert des berechneten Auftragevolumens für 50% Hemmung stellt das reziproke Iso-Hemmvolumen (RIHV) dar. Dieser RIHV-Wert hat sich für den Probenvergleich in verschiedenen Anwendungen bewährt. Das Prinzip der Auswertung kann vom HPTLC-Leuchtbakterientest mit Anpassung auf den HPTLC-Bacillus subtilis-Hemmtest übertragen werden. Für den Vergleich der Wirkung auf die Acetylcholinesterase-Hemmung wird in Anlehnung zum RIHV, das reziproke Iso-Aktivitätsvolumen (RIAV) herangezogen. Hier wird das Auftragevolumen, welches notwendig ist, eine Aktivität der AChE von 50% zu erreichen, als Kehrwert angegeben.
Zur Ermittlung der Messunsicherheit der Chromatographie und der detektierten Wirkung wurden parallel zu den Proben Referenzverbindungen untersucht. Bei der Überwachung einer gesicherten Deponie über einen Zeitraum von 4,5 Jahren konnte gezeigt werden, dass es sich bei der Hochleistungsdünnschichtchromatographie mittels automatisierter
Mehrfachentwicklung (HPTLC/AMD) um ein reproduzierbares Chromatographiesystem handelt. Bei der Anwendung des Leuchtbakterien-, Bacillus subtilis- und des Acetylcholinesterase-Hemmtests auf verschiedene Deponie- und Abwasserproben wurden über einen Zeitraum von 7 Monaten Standardabweichungen von 5-9 % Hemmung für die testspezifischen Referenzsubstanzen ermittelt. Als Ergebnis der Validierung wurden der HPTLC-Aliivibrio fischeri-, der HPTLC-Bacillus subtilis- und der HPTLC-Acetylcholinesterase- Hemmtest am 24.03.2015 von der deutschen Akkreditierungsstelle (DAkkS) akkreditiert (Akkreditierungsurkunde D-PL-18961-01-00).
Zur Ermittlung potenziell gentoxischer Substanzen wurde der umu-Test ausgewählt. Da es sich beim umu-Test auch um einen Test mit einer notwendigen langen Inkubationszeit (2 h) handelt, muss hier ebenso die Bandenverbreiterung durch geeignete Maßnahmen minimiert werden. Hierzu wurde die aufwendige Calciumalginatverfestigung in Kombination mit einer medizinischen Gaze nach Baumann et al. [3] vereinfacht. Mit dem umu-Test auf der HPTLC-Platte ist es derzeit möglich, die aus der DIN 38415-3 [4] bekannte direkt wirkende gentoxische Substanz 4-Nitroquinolin-N-oxid (4-NQO) auf der HPTLC-Platte nachzuweisen. Die Nachweisgrenze für 4-NQO liegt bei einer Auftragemenge von 3 ng. Für einen erfolgreichen Nachweis von indirekt wirkenden Substanzen, die erst nach der Aktivierung durch Stoffwechselenzyme gentoxisch wirken, war es nicht möglich, das erforderliche Metabolisierungssystem auf der HPTLC-Platte aufrecht zu erhalten.
Zur Durchführung der WBA ist für die meisten Wasserproben (z. B. Oberflächenwasser oder Grundwasser) eine Anreicherung erforderlich. Parallel zu den Arbeiten mit den biologischen Testsystemen erfolgte die Optimierung der Anreicherung von organischen Verbindungen aus Wasserproben. Für die Festphasenextraktion (SPE) wurden verschiedene Materialien bei den pH-Werten 2, 7 und 9 mit Substanzen unterschiedlicher Polarität getestet. Die besten Wiederfindungen über den gesamten Polaritätsbereich erzielte die Phase ´Agilent Plexa´ (Polydivinylbenzol) mit einer angepassten Elutionsabfolge. Bei der Auswahl des Materials und der Anpassung der Elutionsabfolge wurde auch auf einen möglichst geringen Blindwert für den Biolumineszenz-Hemmtest mit Aliivibrio fischeri geachtet. Damit wurde eine für die WBA geeignete Anreicherungsmethode gefunden. Zur Verbesserung der Extraktionsausbeute von polaren Verbindungen mittels Flüssig-Flüssig-Extraktion (LLE) wurde die Mikro-LLE mit dem in allen Verhältnissen mit Wasser mischbaren Extraktionsmittel Acetonitril getestet. Die im Blindwert auftretenden störenden Substanzen konnten durch Ausheizen des zur Phasentrennung erforderlichen Natriumchlorids erheblich reduziert werden. Bei den Untersuchungen zur Wiederholbarkeit mit einer Deponiesickerwasserprobe und der Detektion der Biolumineszenz von Aliivibrio fischeri waren nur geringe Abweichungen der Hemmwerte detektierbar.
Aufgrund der zu erwartenden komplexen Zusammensetzung von Proben aus dem Deponiebereich ist eine Gradientenelution für die HPTLC/AMD notwendig. Anhand von Referenzverbindungen und Extrakten aus verschiedenen Deponien wurde die HPTLC/AMD-Trennung für ein Screening optimiert. Mit diesem Screening-Gradient ist es möglich, die wirkenden Probenbestandteile über die gesamte Trennstrecke zu verteilen. Zusätzlich fand noch eine Entwicklung einer isokratischen HPTLC-Trennung für eine schnelle Beurteilung von Proben statt, wobei bei dieser Methode Abstriche bezüglich der Trennleistung gemacht werden mussten.
Zudem konnte gezeigt werden, dass der aufwendige Identifizierungsprozess durch spezifische postchromatographische Derivatisierungsreaktionen auf der HPTLC-Platte unterstützt werden kann. Dazu wurde der Bratton-Marshall-Nachweis von primären Aminen optimiert. Durch den Nachweis von austauschbaren Protonen mittels des H/D-Austausches lassen sich die denkbaren Strukturen deutlich einschränken. Für einen nahezu vollständigen H/D-Austausch hat sich die Kopplung von HPTLC und Massenspektrometer (MS) als besonders geeignet gezeigt, da hier nur wenige Milliliter an deuterierten Lösemitteln benötigt werden.
Erprobt wurden die optimierten Methoden an verschiedenen Wässern, welche aus Kläranlagen und aus dem Umfeld von Deponien stammen. Durch die Einführung des RIHV- bzw. RIAV-Wertes ist es möglich Wässer von verschiedenen Probennahmestellen, z. B. Deponiesickerwässer, anhand ihrer Wirkung vergleichend zu beurteilen. Auch kann damit die Veränderung des Wirkungsmusters über einen Aufbereitungsprozess beobachtet werden. Die Untersuchungsergebnisse zeigen zudem, dass auch bei der WBA Feldblindproben entscheidend sind, um Proben sicher beurteilen zu können.
Kurzfassung auf Englisch: In effect-directed analysis (EDA), the coupling of a chromatographic separation process is understood using a biological test system. The benefit with this approach is that the previously separated substances contained in the sample are detected in vitro in a test system, on the basis of your activity. It has been demonstrated that high performance liquid chromatography (HPLC) is particularly eligible for the EDA [1,2]. The research literature indicated that the EDA is performed with the HPLC on different samples but was not used as a routine method, e.g. for identifying contaminated sites. In this work, detecting the endpoint of the bioluminescence inhibition (Aliivibrio fischeri), antibiotic effect (Bacillus subtilis), and neurotoxicity (Acetylcholinesterase) of the HPLC plate was optimized with regard to routine capabilities. It could additionally be demonstrated in the first trials that it is possible to prove direct genotoxic links using the umu test on the HPLC plate.
Different incubation times are required for the individual biotests, which last from minutes to hours. This leads to a brand broadening due to diffusion on the HPLC plate. Different methods and ways of working to minimise diffusion were tested and optimized. Mechanical containment is one possibility, where gauze is inserted into the solidified calcium alginate layer. The process was optimized on the Bacillus subtilis inhibition assay. It could be demonstrated here that sensitivity is lowered by inserting the gauze, however, thus far a more eligible material has not yet been found.
A comparatively short incubation period is necessary for enzyme tests. As a result a shorter band broadening occurs, whereby the mechanical containment of the diffusion is not eligible. In order to keep the occurring band broadening as minimal as possible, application of the
substrate in particular was optimized. This occurred, as an example, with the HPLC acetylcholinesterase inhibition assay. In comparison to the process described in the literature, outcomes could be substantially improved by spraying the substrate. Nevertheless, a slight band broadening still occurs. The statistical method of ´design of experiment´ is used for determining different band broadening determinants, for example, incubation period, application speed and concentration on the substrate and their mutual influences (interactions). In descending order, the following factors had the greatest influence on the band broadening target figure: Substrate volume > interaction of substrate volume and turnover time of the substrate > turnover time of the substrate = enzyme activity. Using this knowledge, the method could be optimized to such an extent that the band broadening occurring when detecting
AChE inhibitor can be kept very minimal. Based on the high sensitivity of the procedure, low traces of impurities can be detected in the reference substances.
The comparability of the outcomes is particularly necessary for routine use of the EDA with the HPLC. Furthermore, an evaluation strategy was compiled using the HPLC luminescent bacteria inhibition assay with Aliivibrio fischeri. Determining the bioluminescence inhibition takes place analogous to the cuvette test and can be represented as a chromatogram inhibition value that is resolved on location. The representation of inhibition in a inhibition-value chromatogram partially offsets the compression of the peaks based on the sigmoid process of the dose-response relationship. It is necessary to set a reference point for comparing samples due to using the non-linear relationship between concentration or surface dimension and the effect of the unknown substances. EC50 value was proven for this. However, since the concentration is unknown in most cases, the application volume selected as the reference point is chosen based on what is required to trigger an inhibition of 50%. The inverse of the calculated application volume for 50% inhibition represents the reciprocal iso-inhibition volume (RIHV). This RIHV value was proven for the sample comparison in different applications. The principle for the evaluation can, with adjustment, be transferred from the HPLC luminescent bacteria test to the HPLC Bacillus subtilis inhibition assay. In accordance with the RIHV, the reciprocal iso-activity volume (RIAV) is used for comparing the effect on the acetylcholinesterase inhibition. Here the application volume is added as an inverse, which is necessary to reach an acetylcholinesterase activity of 50%.
Reference compounds were assessed parallel to the samples for determining the measurement uncertainty of the chromatography and the detected effect. When monitoring a protected landfill over a period of 4.5 years, it could be demonstrated that it concerns a reproducible chromatographic system with HPLC/AMD. Standard deviations of 5-9% inhibition for the test-specific reference substances were determined when applying the luminescent bacteria, Bacillus subtilis- and the acetylcholinesterase inhibition assay on different landfill and waste water samples over a period of 7 months. As an outcome of the validation, the HPLC Aliivibrio fischeri-, HPLC Bacillus subtilis and the HPLC acetylcholinesterase inhibition assay was accredited on 24/03/2015 by the Deutschen Akkreditierungsstelle (DAkkS [German Accreditation Body) (accreditation document D-PL-18961-01-00)).
The umu test was selected for determining potential genotoxic substances. Since the umu test necessitates a long incubation period (2 hours), the band broadening must also be minimised here through eligible measures. Here, according to Baumann et al., a complex combination of calcium alginate solidification and the medical gauze was simplified for this [3]. Using the umu test on the HPLC plate, it is possible to detect the effective genotoxic substance 4-nitroquinoline-N-oxide (4-NQO) known from DIN 38415-3 [4] on the HPLC plate. The detection limit for 4-NQO is an application amount of 3 ng. It is not possible to keep the required metabolising system upright on the HPLC plate to successfully detect the indirectly acting substances, which only have a genotoxic effect after activation by the metabolic enzymes.
An enrichment is necessary to perform the EDA for most water samples (e.g. surface water or ground water). The enrichment of organic compounds from water samples is optimized in parallel to the work with biological test systems. Different materials were tested for the solid-phase extraction (SPE) with substances of various polarities for pH values 2, 7 and 9. The best recovery across the entire polarity range was achieved by the phase ´Agilent Plexa´ (polydivinylbenzene) with an adjusted elution sequence. When selecting the material and adjusting the elution sequence, a blank value as low as possible was regarded on the bioluminescence inhibition assay with Aliivibrio fischeri. Consequently, an enrichment method eligible for the EDA was found. To improve the extraction yield of polar compounds using liquid-liquid extraction (LLE), the micro LLE were tested along with the extractant acetonitrile, which is miscible in water in all conditions. The occurring substances disturbing the blank value could be significantly reduced by heating the sodium chloride required for
phase separation. Only few deviations in the inhibition value could be detected when investigating reproducibility with a landfill soil water sample and detecting the bioluminescence of Aliivibrio fischeri.
Based on the expected complex structure of samples from the landfill area, a gradient elution is necessary for the high performance liquid chromatography using automatic multiple development (HPLC/AMD). Based on the reference compounds and extracts from various landfills, the HPLC/AMD separation was optimised for a screening. With this screening gradient, it is possible to distribute the acting sample constituents across the entire isolating distance. Moreover, a development of an isocratic HPLC separation still occurred for a quick assessment of the samples, whereby it was necessary for compromises to be made for this method with regard to separation efficiency.
Additionally, it could be demonstrated that the extensive identification process can be facilitated by specific post chromatographic derivatization reactions on the HPLC plate. The Bratton-Marshall test was optimised by primary amines. The conceivable structure can be significantly limited by testing the exchangeable protons using the H/D exchange. The coupling of HPLC and mass spectrometer was demonstrated as particularly eligible for a nearly complete H/D exchange because only a few millilitres on the deuterated solvent are required here.
The optimized methods were tested on different water samples, which come from sewage treatment plants and from the surrounding landfill areas. It is possible to comparatively assess water from different sampling locations, e.g. landfill leachate, by introducing RIHV or RIAV values based on their effect. This means that the change in impact pattern can be observed across treatment processes. The assessment outcomes also demonstrate that field blank tests are also crucial with the EDA in order to be able to reliably assess samples.


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Letzte Änderung: 10.11.16